原位杂交探针的设计与合成，核心是根据实验目标选择合适的探针类型，并通过体外转录等方法制备标记探针。针对不同的应用场景（如组织切片、细胞样本或染色体标本），具体流程会有所差异。
目前主要有三种探针方案：RNA探针、DNA探针、寡核苷酸探针。

无论选择哪种探针，设计时都应遵循以下原则以确保实验成功：

长度控制：RNA探针用于杂交时建议150-200个碱基，过长需碱水解以提高组织渗透性；模板质粒长度最好不超过1.5 k。-

• 特异性：探针序列应与靶标RNA高度互补，与其他基因无明显匹配，通常GC含量控制在40%-60%-。

• 方向确认：用于检测的反义探针与靶标互补；做阴性对照的正义探针与靶标序列相同-。

🛠️ 以RNA探针为例的通用合成流程

这是实验室常用的方法之一，尤其是制备（DIG）标记的探针-。

1. 前期准备：获取模板

模板扩增：通过PCR扩增或质粒扩增获取包含目标序列的DNA片段-。

载体克隆：将该片段克隆至含SP6、T7或T3启动子的专用载体（如pGEM-T）上。

2. 核心步骤：质粒线性化

酶切：选择合适的限制性内切酶，在目标序列的下游将环状质粒切开，得到线性的DNA模板，这能确保转录在目标序列处终止-。

纯化：通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除酶和杂质，得到纯净的模板-。

3. 关键步骤：体外转录与标记

体系配置：在无RNase的离心管中混合线性化模板、RNA聚合酶、缓冲液和DIG-RNA标记混合液（含DIG标记的UTP）。

• 反应：37℃孵育约2小时，RNA聚合酶会以DNA为模板合成大量掺入DIG标记的RNA探针-。

4. 后处理：纯化与水解

去除模板：加入无RNase的DNase I，消化掉作为模板的DNA-。

探针水解：若探针过长，需在60℃用碳酸盐缓冲液水解至理想长度，然后通过乙醇沉淀浓缩回收-。