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更新时间:2025-03-06
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多重免疫组化染色实验步骤
样本准备:包括石蜡切片、冰冻切片或细胞爬片等的处理,如固定、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶等。
一抗孵育:滴加用抗体稀释液稀释好的一抗,在避光湿盒内孵育一定时间。
二抗孵育:洗涤后加入与一抗相应种属的HRP标记二抗,避光室温孵育。
TSA荧光染料染色:滴加酪胺荧光染料,室温反应一段时间后洗涤。
抗体洗脱:采用热修复或抗体洗脱液等方法洗脱前一轮的抗体,以便进行下一轮标记。
重复标记:重复上述步骤,使用不同的一抗和荧光染料,实现多重标记。
复染细胞核及封片:用DAPI等核染料复染细胞核,滴加抗荧光淬灭封片剂封片。
镜检拍照:在荧光显微镜等设备下观察并采集图像。
多重免疫组化染色注意事项
抗体选择与优化:要选择特异性高、经过验证的抗体,并优化抗体的浓度和孵育时间等条件。
表位掩蔽问题:注意抗体的染色顺序,避免表位掩蔽现象,可通过调整抗体顺序或采用其他方法来解决。
实验对照设置:设置阳性对照和阴性对照,以确保实验结果的准确性和可靠性。
信号放大倍数的控制:根据具体实验需求和荧光信号强度,合理选择是否添加TSA增强剂等手段来控制信号放大倍数。